Pieribone + Chen の in vivo 膜電位イメージング論文を題材に、遺伝学的膜電位センサー(GEVI)、広視野+高速２光子顕微鏡、U-Netベースのノイズ除去手法について掘り下げました (4/30収録) Show Notes (完全版)： Allen Institute for Neural Dynamics の SAC クラカウア―のアンチreductionistペーパー 題材とした論文：High-speed low-light in vivo two-photon voltage imaging of large neuronal populations Vincent Pieribone Jerry Chenラボ GEVIパート 黎明期のプローブ FlaSh (Siegel and Isacoff 1997) SPARC (Ataka and Pieribone 2002) VSFP1 from Knopfelラボ (Sakai et al.)   ただし、黎明期プローブは膜上に移行しづらく使いにくいという問題があり、使いづらかった。 GEVI開発で気を付ける点は以下（St-Pierreによるレビュー⁠を参照） 細胞質ではなく膜上にセンサー分子がある局在する必要があるため、センサーのTraffickingが良く無ければいけない 膜状にしか存在できないため、利用可能なセンサー分子の数が少ない。暗いし、SN比の要求が高い 上の問題に付随して、照射強度を強くする必要があるため、褪色が速い 脱分極に対して蛍光が増えるか減るか 二光子励起ができるか 2005年に岡村先生が報告したホヤ(Ci)由来の電位依存ホスファターゼ（VSP）の電位感受ドメイン（VSD）は膜移行性が良く、これを用いたプローブが2007年から出てきた。また、2011年にはロドプシンが電位依存的に蛍光を変化させるタンパク質として使えることが報告された。現在では、この２つの電位センシングモチーフが主に使われている。 1. Voltage sensitive phosphataseのVSDを使った系列 1-1: VSDの末端に２つの蛍光タンパク質をつけてFRETするタイプ VSFP2 Mermaid VSFP-Butterfly 1.2 Mermaid2と2β ただしkinetics遅め 1-2: VSDのC末に蛍光タンパク質を入れるタイプ（特にpHluorine改変体） ArcLight ArcLightメカニズム論文  Marina 正の方向への変化 VSDのC末に入れるタイプは、FRETもArcLightもキネティクスが遅い。しかしArcLightについては未だにGEVIの中で一番大きい蛍光強度変化を示す。 1-3: VSDの細胞外ループにcpGFPを挿入するタイプ ASAP1  from Michael Linラボ, NN 2014。Francois St-Pierreが筆頭。VSDベースでキネティクスが良いモノを作るのが目標。VSDは4回膜貫通型タンパク質であるが、そのHelix３-４間のextracellular loop のうち、A147-T148の間) に円循環変異を施したsfGFP-OPTを入れる。 ASAP2s ASAP2f ASAP3 ASAP4 正の方向への変化 JEDI-2P 二光子でスクリーニング SpikeyGi1&2 今回の論文 予備知識： GFPが光るしくみ：Ser65–Tyr66–Gly67が自己触媒反応（特にArg96とGlu222に依る）を経て蛍光団HBIを形成し、チロシン由来フェノール基が脱プロトン化されると励起可能になる。脱プロトン化に主に関わる残基はHis148, Thr203, Ser205（GFPの構造論文）。 ちなみにGCaMP2では、GFPで言う203番目のthreonine側鎖の方向が本来あるべき位置に近づくこと、His148の代わりにCaMのArg377が水分子を介してHBIと水素結合を形成すること、が発色団の脱プロトン化に重要らしい（GCaMPの構造論文） cpGFP：GFPの円循環変異では、N末・C末をリンカーで繋ぎ、144番目の残基と145番目の残基新しくC末・N末としているものが主流。つまり、GFPのHis148はcpGFPではHis4となる。 2. ロドプシン系列 予備知識： ロドプシンのPhotocycle（神取先生レビュー）：ground state→L→M1→M2→N→Ｏ ⁠電位依存